1: ВАКЦИНЫ
2: ВАКЦИНЫ это препараты, содержащие антигены (АГ) возбудителей инфекционных заболеваний, и предназначенные для создания искусственного активного иммунитета с целью профилактики и лечения соответствующего заболевания.
4: Компоненты комплекса АГ-АТ - разрушают мембраны клеток м/о, активируют фагоциты, генерируют сигналы, мобилизующие другие компоненты системы иммунного ответа (ТН –лимфоциты, эффекторные клетки, механизмы воспаления и т. д. – см. предыд. лекцию)
6: Вакцины нового поколения Лишены недостатков традиционных вакцин. Для их разработки применяют методы генной инженерии.
7: Если антитела, вырабатываемые в ответ на введение традиционных вакцин, связываются с поверхностными белками патогенного м/о и этого бывает достаточно для запуска иммунного ответа, то должна ли вакцина содержать целые клетки? Если антитела, вырабатываемые в ответ на введение традиционных вакцин, связываются с поверхностными белками патогенного м/о и этого бывает достаточно для запуска иммунного ответа, то должна ли вакцина содержать целые клетки? М. б. достаточно лишь каких-то специфических поверхностных компонентов?
8: установлено Строение вируса млекопитающих. ДНК или РНК заключена в белковый капсид. У некоторых вирусов капсид окружен еще и белковой оболочкой
9: 1. Субъединичные вакцины Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного м/о
10: Создание и производство субъединичных вакцин
11: Преимущества и недостатки субъединичных вакцин Преимущества: очищенный иммуногенный белок стабилен Безопасен (в сравнении с патогенным м/о – живым или аттенуированным) его химические свойства известны в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызвать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяине (аллергические) Недостатки: очистка специфического белка дорогостоящая конформация выделенного белка может отличаться от конформации in situ (в составе вирусного капсида), что может приводить к изменению его антигенных свойств (отсюда непостоянство активности)
12: Субъединичная противогерпетическая вакцина HSV – herpes simplex virus - вирус простого герпеса. Вызывает не только заболевания местного и общего характера (глаза, гениталии, энцефалит и т. д. ). Он является онкогенным, поэтому вакцинация убитым или аттенуированным вирусом сопряжена с риском развития рака. В этой связи ВОЗ запретила применение в медицине традиционной противогерпетической вакцины Субъединичная противогерпетическая вакцина безопасна, т. к. не содержит вируса, а также ДНК, кодирующей развитие раковых клеток.
13: Создание и производство вакцины против герпеса простого
14: Идентификация АГ-активного компонента HSV Установлено, что в HSV выработку антител индуцирует гликопротеин D вирусной оболочки (gD HSV). В ответ на введение мышам gDHSV (очищенного от других вирусных фрагментов) у них вырабатываются АТ, нейтрализующие HSV.
15: Идентификация генов, кодирующих АГ-активный компонент HSV Ген, кодирующий gD HSV, был изолирован и клонирован в клетках млекопитающих (мыши). Такой белок трудно отделить от клетки-продуцента и очистить.
16: Получение АГ-белка Поэтому ген gD HSV модифицировали, удалив ту его часть, которая кодирует трансмембранный домен. В результате получили белок D HSV, не содержащий трансмембранного домена. Полученный белок уже не связывался с мембраной клетки хозяина (продуцента) и легко растворялся в клетках и межклеточном пространстве.
17: Получаение АГ-белка Однако для выработки точно специфичных АТ важно было получить не просто протеин, а гликопротеин. Для этого модифицированным геном трансформировали яйцеклетки китайского хомячка - единственный подходящий продуцент. В отличие от клеток мыши и E. Coli (и пр. продуцентов) в яйцеклетках китайского хомячка происходит гликозилирование всех чужеродных белков (гликозилирование - ковалентное присоединение сахарного остатка к белковой молекуле). В яйцеклетках китайского хомячка модифицированный ген генерирует выработку белка, который воспринимается хозяйской клеткой как чужеродный белок и, следовательно, происходит его гликозилирование В результате образуется растворимый гликопротеин, который выбрасывается (экскретируется) клеткой во внешнюю среду, как чужеродное вещество. При введении очищенного модифицированного гликопротеина в организм человека вырабатываются АТ, эффективные в отношении HSV
18: Субъединичная противотуберкулезная вакцина В стадии разработки. Возбудитель туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis. 2 млрд людей инфицировано. Актуальность обусловлена тем, что традиционная вакцина, созданная на основе ослабленного штамма Mycobacterium bovis - Bacillus Calmette-Guerin – вакцина BCG, используемая в настоящее время, вызывает: заболевание у иммуноослабленных пациентов BCG-вакцинированные лица дают положительный ответ на обычную процедуру выявления туберкулобактерий (Манту, Пирке), что не позволяет отличить их от больных туберкулезом.
19: Субъединичные пептидные вакцины А может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить субъединичной вакциной и индуцировать выработку АТ?
20: Субъединичные пептидные вакцины Интуитивно - да: те участки, которые находятся на поверхности вируса и доступны для АТ обладают иммуногенными свойствами, а внутренние участки несущественны, если только они не влияют на конформацию иммуногенного домена. Если так, то короткие пептиды, имитирующие АГ, можно использовать для создания вакцин.
21: Субъединичные пептидные вакцины Химическими методами синтезировали белковые домены, идентичные поверхностным белкам патогенного для морских свинок вируса, и сшили их по-отдельности с инертным белком-переносчиком (для предотвращения их разрушения) Ввели морским свинкам. Наблюдался ярко-выраженный иммунный ответ. Но доза такой вакцины выше, чем в случае убитой вакцины.
22: 2. Генетически аттенуированные вакцины Вакцины, содержащие целые живые м/о, но с удаленными генами, кодирующими домены вирулентности
23: Создание генетически аттенуированных вакцин Патогенный м/о подвергают генетической модификации: делетируют (delet - удалять) гены, ответственные за вирулентность или за жизненноважные функции м/о; но (ВАЖНО!!!) сохраняют АГ-кодирующие домены ДНК
24: Создание генетически аттенуированных вакцин Основное требование: эти вакцины, являясь живыми, не должны ревертировать и становиться патогенными. Для предупреждения ревертирования необходимо: Делетировать, как минимум, 2 области ДНК: кодирующую вирулентность м/о и какую-либо жизненно важную функцию; вероятность их одновременного восстановления очень мала.
25: Генетически аттенуированная противосальмонеллезная вакцина Разные штаммы Salmonella вызывают острые кишечные инфекции, брюшной тиф, пищевую токсикоинфекцию. Аттенуированные штаммы сальмонеллы получают путем делеции отдельных доменов в генах ARO, кодирующих ферменты биосинтеза ароматических соединений и генах PUR, кодирующих ферменты метаболизма пуринов. Такие штаммы вызывают легкую форму инфекции и обладают в 1 000 000 раз меньшей вирулентностью.
26: Генетически аттенуированная вакцина вибриона холеры Находится в стадии разработки Актуально, т. к. используемая в настоящее время – на основе холерных вибрионов, убитых фенолом, обеспечивает частичную защиту на ограниченное время – не более 3-6 месяцев
27: 3. Векторные вакцины Живые вакцины, полученные путем клонирования генов, кодирующих основные АГ патогенного м/о, и встраивания их в геном непатогенного носителя (обычно вируса)
28: В качестве непатогенного носителя используют ВКО – вирус коровьей оспы Геном ВКО изучен и воспроизведен Проникая в клетку хозяина (макроорг-ма), ВКО начинает реплицировать свою ДНК в цитоплазме инфицированной клетки, т. к. у вируса имеются гены ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и гены ферментов, иницииру-ющих синтез мРНК. Вновь синтезированная ДНК ВКО обрастает белковой оболочкой, образуя новые вирусы
29: Встраивание в ДНК ВКО гена, кодирующего АГ Если в геном ВКО встроить чужеродный ген, кодирующий АГ, то он будет экспрессироваться независимо от регуляторных и ферментных систем клетки-хозяина. Можно встроить ДНК, кодирующую несколько АГ. Таким образом получают векторные ПОЛИвакцины на основе ВКО, которые позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний.
30: Векторные вакцины на основе ВКО В геном ВКО уже удалось встроить и экспрессировать в культуре животных клеток несколько генов антигенных белков: АГ-белка вируса бешенства, АГ гепатита В, белков вируса гриппа. ВКО остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды через замораживание) и не обладает онкогенными свойствами. Поэтому широко используется для создания векторных вакцин. С его помощью в организм-хозяина (человека) доставляют и экспрессируют гены, кодирующие АГ-белки, которые в свою очередь индуцируют выработку АТ.
31: Генная иммунизация Позволяет индуцировать в макроорганизме иммунный ответ без введения АГ Основан на включении в клетки организма ГЕНА, кодирующего белок АГ. В одном из экспериментов ДНК, кодирующую белок АГ, соединили с плазмидой кишечной палочки pBR322. Плазмиду ввели В/М в организм мышей. Более чем в 75 случаев ген включался в клетки мыши и начинался синтез белка АГ Белок АГ индуцировал синтез АТ. Этот подход позволяет избежать дорогостоящего процесса очистки АГ (в будущем)
32: Лекарства против СПИДа Вакцина ВИЧ
33: ВИЧ поражает один из видов лимфоцитов (иммунных клеток крови)– Т-хелперы (Тн-клетки). В норме эти клетки связывают продукты разрушения АГ (или комплекса АГ-АТ) и активизируют факторы, стимулирующие другие клетки иммунной системы к участию в иммунном ответе. ВИЧ поражает один из видов лимфоцитов (иммунных клеток крови)– Т-хелперы (Тн-клетки). В норме эти клетки связывают продукты разрушения АГ (или комплекса АГ-АТ) и активизируют факторы, стимулирующие другие клетки иммунной системы к участию в иммунном ответе. Т. о. Тн-клетки играют ключевую роль в формировании иммунного ответа, а при ВИЧ-инфекции они перестают функционировать. В этой связи несмотря на то, что к ВИЧ вырабатываются АТ, иммунный ответ организма отсутствует. Больной погибает от банальных инфекций.
34: 1 этап ВИЧ-инфицирования На первом этапе ВИЧ-инфекции происходит взаимодействие между гликопротеином оболочки ВИЧ (gp120м. м) и рецептором на поверхности Тн-клеток – поверхностным белком СD4,
35: 2 этап ВИЧ-инфицирования После связывания с Тн клеткой ВИЧ проникает в нее и становится защищенным от иммунной системы организма В результате размножения ВИЧ в инфицированной Тн-клетке происходит лизис клетки Пораженная Тн-клетка работает как фабрика по производству ВИЧ-гликопротеина gp120, который и вызывает разрушение других Тн-клеток
36: Возможные пути защиты Тн-клеток от ВИЧ 1. In vitro поражение вирусом Тн-клеток блокируется антителами к СD4; 2. процесс замедляется также при избытке белка СD4, но ВИЧ не погибает ни в 1, ни во 2 случае; 3. Создание химерного белка, состоящего из фрагмента молекулы СD4 и Fc-фрагмента специфического АТ. Такой белок синтезирован, называется СD4 - иммуноадгезином
37: Возможные пути терапии СПИДа СD4-иммуноадгезин связывает gp120 и блокирует ВИЧ или инфицирован-ный Тн, а белок АТ замедляет разрушение молекулы СD4 в плазме и ее связывание с клетками, несущими рецептор к АТ. Фрагмент АТ (Fc-фрагмент) запускаются реакции АТ, обеспечивающие уничтожение вируса или пораженной клетки.
